数字PCR是一种高灵敏度的核酸绝对定量分析技术，它继实时荧光定量PCR之后，为科研和临床领域提供了更为精确和可靠的核酸定量方法。数字PCR系统通过独特的工作流程，实现了对核酸样本的精确分区和扩增，从而能够准确计算出核酸拷贝数，为基因突变检测、拷贝数变异分析、病毒微生物检测等领域提供了强大的技术支持。
一、工作流程
数字PCR系统的工作流程包括样本制备、反应体系制备、分区或微滴生成、封盖和热循环、荧光信号检测以及数据分析等步骤。
1、样本制备：
这是数字PCR的第一步，涉及从生物样本中提取DNA或RNA，或者使用已经制备好的核酸样本。样本的质量和纯度对后续的实验结果至关重要，因此，这一步需要严格遵循实验操作规程，确保样本的完整性和代表性。
2、反应体系制备：
根据数字PCR仪器和试剂的要求，制备包含引物、探针、dNTPs（脱氧核糖核苷酸三磷酸）、酶和缓冲液等的反应体系。这一步骤要求精确控制各组分的比例和浓度，以保证PCR反应的顺利进行和扩增效率。
3、分区或微滴生成：
将制备好的反应体系分配到大量的微小分区或微滴中。这些分区或微滴是通过微流控技术、油包水乳化或其他方法生成的，每个分区或微滴都包含有反应所需的全部组分，且相互独立。这一步骤是实现高精度和高灵敏度的基础。
4、封盖和热循环：
将分区或微滴进行封盖，以防止在热循环过程中的液体蒸发和污染。随后，进行PCR热循环，使目标核酸在每个分区或微滴中进行扩增。热循环过程中，通过精确控制温度和时间，确保目标核酸的有效扩增。
5、荧光信号检测：
在热循环过程中，使用荧光染料或探针来监测目标核酸的扩增。当目标核酸被扩增时，荧光信号强度会相应增加。每个分区或微滴中的荧光信号强度与其中存在的目标核酸数量成正比，这为后续的定量分析提供了依据。
6、数据分析：
使用专门的软件或分析方法，对每个分区或微滴的荧光信号进行分析。根据泊松分布和阳性比例，计算出核酸拷贝数，实现定量分析。这一步骤需要强大的数据处理能力和统计分析技能，以确保结果的准确性和可靠性。
二、优势
1、高精度：
数字PCR技术通过将反应体系分配到大量独立的分区或微滴中，使得每个分区或微滴中的核酸拷贝数相对固定且可计数。这种方法避免了传统PCR中由于模板浓度不均一而导致的误差，从而实现了对核酸拷贝数的精确测量。因此，在基因表达、基因突变检测等领域具有更高的精度和可靠性。
2、高灵敏度：
它能够检测到非常低浓度的核酸样本，甚至能够检测到单个拷贝的核酸分子。这种高灵敏度使得数字PCR在病毒检测、肿瘤标志物检测等领域具有广泛的应用前景。同时，还能够通过优化反应体系和条件，进一步提高检测灵敏度，满足更多领域的需求。
3、无需标准曲线：
传统PCR技术通常需要通过绘制标准曲线来进行定量分析，而数字PCR技术则无需这一步骤。因为数字PCR是根据每个分区或微滴中的荧光信号强度来计算核酸拷贝数的，因此无需依赖外部标准品进行校正。这一特点简化了实验操作流程，减少了实验误差，提高了实验效率。
4、多重检测能力：
可以在单个PCR反应中同时检测多种核酸序列。这使其在复杂样本的分析中更具优势，能够同时获取多种目标核酸的信息，提高了实验的效率和准确性。
5、高耐受性：
对抑制剂和污染物的耐受性较高，能够在复杂的环境中进行稳定的PCR扩增。这使得数字PCR在实际应用中更具灵活性和适应性，能够应对各种复杂的实验条件。
